从同源四倍体紫苜蓿基因组来聊一聊基因组分型
基于Hi-C数据分型的原理
Hi-C数据构建单体型的方法，称作HaploSeq方法，采用 HapCUT软件分析[4]，后面这个软件升级到HapCUT2[5]，其原理是根据染色体内互作强于染色体间（及同源染色体间）互作，通过Hi-C contact将检测到的变异组合联系起来，从而区分同源染色体。
ALLHIC分型方法[2-3]
在进行同源四倍体甘蔗基因组组装时，直接采用现有工具，如Lachesis，3d-dna甚至SALSA，结果都不如人意，表现在这些辅助组装软件会将allelic contigs放到邻近的位置，这样就会隔开本来在染色体邻近的contigs，导致组装错误。因此，很自然会想到先去除allelic contigs之间的互作，再进行组装。
prune方法在去除单倍体间互作的应用
备注：去除allelic contigs之间的Hi-C互作（如d中蓝色线条间互作），仅保存与collapsed contigs（红色）互作最强的haplotype contig（蓝色）
另外一个问题是，多倍体杂合度较高，直接采用组装软件进行组装，草图的连续性往往不高，如同源四倍体甘蔗文章中用canu组装完后的contig N50仅45kb，同源四倍体紫苜蓿采用canu组装CCS reads，组装出的草图contig N50也只有459 Kb。为了解决这个问题，作者将遗传算法应用到ALLHIC程序中，经过测试发现contig N50从131kb-1.19Mb均能取得较好的结果。
同源四倍体紫苜蓿基因组组装策略[1]
（1）基因组评估
文章作者先对基因组的基本信息进行评估，通过k-mer深度的方法评估出k-mer峰为38X时基因组大小1,578,294,649 bp(即两套单倍体基因组大小)，而用k-mer峰19X来评估，基因组大小为3,156,589,298bp(即四套单倍体基因组大小)（图5）。另外，采用流式细胞术进一步验证了基因组大小。另外通过评估，其杂合度高达3.7%。后面通过canu实际组装的结果来看，这一评估可以说在高杂合基因组的评估中是相当准确了。
（2）基因组组装
从成本上考虑，目前大多数的基因组组装都会直接采用PacBio subreads，但同源四倍体紫苜蓿一开始目标就是获得高质量的参考基因组。因此，采用了高精确度的CCS reads(CCS reads N50为12,604bp，总长度约70G)，这是组装中测序技术应用的一大亮点，最后组装出的草图3,154Mb，contig N50为459kb。
（3）同源四倍体基因组的分型
同源四倍体紫苜蓿分型的核心也是采用了甘蔗中ALLHIC工具。二倍体近缘种蒺藜苜蓿(M. truncatula，核型2n=2x=16)已有染色体水平的基因组，可作为ALLHIC流程中的参考基因组，用来获取allelic contigs信息。文章中测了383G Hi-C数据，采用HiC-Pro质控获取到约1,277 million read pairs，再采用ALLHIC流程完成分型，分型后采用Juicerbox进行了微调和打磨。最终结果是区分出32条染色单体，总长度2,738Mb，约占总的草图大小86.81%。
基因组分型后的的验证工作
完成分型工作后，文章作者精益求精，又做了大量验证工作，这也是整个工作中的另一大亮点，也是值得我们借鉴的地方，具体验证的方法有：
(1) 将全部Hi-C reads比对回分型后的结果，绘制互作热图，可以清晰的分出8组染色体，每组有4个染色单体。
(3) 获得了99G Nanopore测序数据(平均长度16Kb)，取最长的200条reads，将其比对到分型后的染色体上，89%的reads仅能比对到一条染色单体，且比对长度达到reads长度的80%。
(4) 进行BUSCO评估，而且将转录组数据比对到分型后的染色体上，比对率也可达到90%以上。注释出的164,632蛋白编码基因，其中95.4%的基因可以注释到NR，GO，KEGG，Swiss-Prot和TrEMBL数据库，表明基因组相对完整。
(5) 通过外部数据评估基因组后，自然也会想到四套单倍体基因组之间的比较。结果发现四套单倍体基因组之间相似性非常高。这种相似性不仅体现在序列和功能上，包括单倍体基因组大小，基因数和重复元件数量，也体现在Ka/Ks ratio和表达量上，例如各种染色单体FPKM值比较如下：
菲沙基因自成立之初就开始提供Hi-C实验和分析工作，也不断将Hi-C技术应用到新的技术领域，其中基因组分型是Hi-C辅助组装基因组组装后的又一应用领域，菲沙基因基于HapCUT2软件自主开发了分型效果更佳的流程，目前已应用于高杂合二倍体基因组分型工作中，同时也在基于ALLHIC进行同源多倍体基因组分型工作。
参考文献：
[1] Haitao Chen, Yan Zeng, Yongzhi Yang, et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa. Nature communications. doi:10.1038/s41467-020-16338-x (2020).
[2] Zhang J, Zhang X, Tang H, et al. Allele-defined genome of the autopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L[J]. Nature genetics, 2018, 50(11): 1565-1573.
[3] Zhang X, Zhang S, Zhao Q, et al. Assembly of allele-aware, chromosomal-scale autopolyploid genomes based on Hi-C data[J]. Nature plants, 2019, 5(8): 833-845.
[4] Selvaraj S, Dixon J R, Bansal V, et al. Whole-genome haplotype reconstruction using proximity-ligation and shotgun sequencing[J]. Nature biotechnology, 2013, 31(12): 1111.
[5] Edge P, Bafna V, Bansal V. HapCUT2: robust and accurate haplotype assembly for diverse sequencing technologies[J]. Genome research, 2017, 27(5): 801-812.